• 专利附录
  • 专利说明
  • 权利要求
  • 类似技术
  • 同族专利
  • 引用文献
  • 法律状态
  • 优先权
    • 专利摘要:
    提供一種不須投予藥劑、可簡單且良好地控制，用於誘導活細胞內抗細胞凋亡效果及/或抗壞死效果的方法。以流通25μA以上75μA以下之電流的方式對活細胞施加交流電壓，藉此誘導活細胞內抗細胞凋亡效果及/或抗壞死效果。可將培養細胞用作為上述活細胞。上述交流電壓，只要施加於載置有保持上述活細胞之收容器的載置構件即可。
    公开号:TW201300527A
    申请号:TW101102154
    申请日:2012-01-19
    公开日:2013-01-01
    发明作者:Shohta Kodama；Tomoyuki Godai
    申请人:Univ Fukuoka；Mayatec Co Ltd；
    IPC主号:C12N13-00
    专利说明:
    抗細胞凋亡或抗壞死誘導方法
    本發明係關於一種用於誘導活細胞中抗細胞凋亡效果及/或抗壞死效果之方法。
    先前已知有以下技術：以流通1μA以上1000mA以下之微弱電流的方式將10V以上5kV以下的交流電壓施加於被處理物，藉此抑制咖啡氧化或保持蔬菜類的鮮度(參照專利文獻1及2)。然而，利用微弱電流來抑制食品氧化及保持鮮度的機制仍不明確。
    另一方面，所謂細胞凋亡(apoptosis)已知係指一種構成多細胞生物體之細胞的死亡方法，為了使個體保持在更佳的狀態而被積極地引起之細胞自殺，亦即被程序化的細胞死亡。相對於此，因血液循環不良、外傷等所導致之細胞內外環境的惡化而引起的細胞死亡，被認定為壞死(necrosis)。為了抑制該等細胞凋亡及壞死，已知有對活細胞投予各種藥劑，並誘導抗細胞凋亡效果或壞死效果，但於先前完全不知道藉由流通對活細胞形成物理學刺激之電流來誘導抗細胞凋亡效果或抗壞死效果一事。
    [專利文獻1]日本特開2004-305046號公報
    [專利文獻2]國際公開2008/096631號
    有鑑於上述現況，本發明之目的在於：提供一種不須投予藥劑、可簡單且良好地控制，用於誘導活細胞內抗細胞凋亡效果及/或抗壞死效果的方法。
    此次，申請人等探討微弱電流對活細胞造成的影響，結果，預料之外的發現於極低之特定電流值範圍中，活細胞內之抗細胞凋亡效果及/或抗壞死效果被誘導，並完成本案發明。
    亦即，本發明係關於一種活細胞內之抗細胞凋亡及/或抗壞死誘導方法，其特徵在於以流通25μA以上75μA以下之電流的方式對活細胞施加交流電壓。
    於本發明中，可將培養細胞用作為上述活細胞。又，上述交流電壓的電壓值較佳為10V以上5kV以下。
    具體的實施態樣為將上述交流電壓施加於載置有保持上述活細胞之收容器的載置構件，藉此可實施本發明。
    藉由本發明，不須投予藥劑即可簡單且控制良好地誘導活細胞內抗細胞凋亡效果及/或抗壞死效果。
    圖1係表示於本發明之一實施型態中可使用的交流電壓施加裝置之結構的示意圖。該交流電壓施加裝置1具有處理槽2。該處理槽為通常之細胞培養時所使用的可密閉之培養機器即可。該培養機器藉由將內部的溫度及溼度保持於一定而可進行細胞培養。處理槽2具有箱形，以導電性材料構成壁部。於處理槽2之壁部的一部份，設置有用於將保持活細胞的收容器6取入取出之門2a。
    於處理槽2內部，配設有載置台5。載置台5具有例如：立設於由電絕緣性材料所構成之處理槽2之底面的支持構件4，與配設於支持構件4之前端且由導電性材料構成之板狀載置構件(桌)3。於該載置構件3上載置有收容器6。收容器6通常為上面具有凹槽之容器，活細胞被收容並保持於該凹槽。一般而言，用以保持活細胞的玻璃或樹脂製培養皿被用作收容器6。
    交流電壓施加裝置1具有變壓器7，變壓器7之一對二次側輸出線的一邊之端子9為絕緣且並未連接於任何地方。如上所述，於本實施型態中，因為與將電壓施加於收容器6側之相反側的輸出端子被絕緣，故與該輸出端子開放之情況相比，負載阻抗變小，因此，可降低變壓器7之輸出電壓。又，變壓器7之一對二次側端子的另一邊隔著安全電阻RO而藉由配線11連接於處理槽2之載置台5的載置構件3。配線11與處理槽2之壁部適當地電絕緣。而且，可藉由未圖示電壓操作部來調整一次電壓V1，藉此，可調整施加於收容器6的負載電壓VL。
    接著，針對使用上述方法而構成之交流電壓施加裝置對活細胞流通微弱電流，並保持活細胞而誘導抗細胞凋亡效果及/或壞死效果之方法進行說明。
    首先，開關處理槽2的門2a，將保持有活細胞的收容器6放置於載置台5之載置構件3上。
    接著，將一次電壓V1施加於變壓器7之一對的一次側端子間。此處，該一次電壓V1係商用周波數的正弦波交流電壓。然後，二次電壓V2被誘發於變壓器7之二次側端子間，由該二次電壓V2減去安全電阻R0所導致之電壓下降所得之負載電壓VL被施加於收容器6。因為收容器6與經絕緣之端子9之間藉由支持構件4與2次側端子間的空氣而被絕緣，故將根據收容器6與2次側端子間空氣之間的負載阻抗(漏電阻或電容)而得之負載電流流通於變壓器7之二次側電路甚至是收容器6。該負載電流非常微弱。因為收容器6與2次側端子間空氣之間的負載阻抗非常大。而且，因為該微弱的負載電流而使保持於收容器6內之活細胞中的細胞凋亡及/或壞死之發生被抑制。
    於本發明中，其特徵在於使用微弱電流。且，負載電流的電流值在25μA以上75μA以下之極狹小的範圍內，可誘導活細胞內的抗細胞凋亡效果及/或抗壞死效果。最佳為在50μA附近(40μA～60μA)。
    進一步，本發明利用交流電壓，使用直流電壓無法誘導抗細胞凋亡效果及/或抗壞死效果。
    用以誘導抗細胞凋亡效果及/或抗壞死效果之通電時間並無特別限制。即便使用短時間亦可得到相對應的效果，但較佳為12小時以上，更佳為24小時以上。若通電時間變得過長，則相反的，會有誘導細胞凋亡或壞死之虞，因此例如設為48小時以內為較佳。
    本發明中可使用的活細胞並無特別限制，可使用從人、老鼠、小鼠等哺乳類或鳥類等的多細胞生物採集而得的活細胞。又，活細胞可使用於一般的培養條件下經培養之活細胞。
    關於培養條件亦無限定。只要根據活細胞的種類選擇適當的溫度、溼度、環境、培養液、及添加劑即可。如上所述，於本發明中，於一般的條件下培養培養細胞，並流通微弱電流，藉此可較佳的誘導抗細胞凋亡效果及/或抗壞死效果。
    [實施例]
    以下揭示實施例來進一步詳細說明本發明，但本發明並不被限定於該等實施例。
    材料及方法
    (1)細胞
    於以下的試驗中，將源自於老鼠之市售細胞NIH3T3(ATCC,Manassas,VA)用作為培養細胞。將經冷凍保存之該細胞解凍後，進行繼代培養至5代，使細胞增殖穩定後，供實驗使用。
    (2)培養環境
    將5代的NIH3T3細胞(2×107 cell/dish)、10%胎牛血清、1%抗生劑及抗真菌劑，以及細胞培養液一起放入60mm細胞培養用培養皿(BD Bioscience,Bedford,MA)中，相對於培養皿內細胞可最大限度培養之增殖為100%，將細胞培養至80%左右。
    於Thermo公司製造的組織/細胞培養器內進行培養。於該培養器內，配置電絕緣性的支持構件，進一步於該構件上配置導電性載置構件。於該載置構件上靜置上述培養皿，並將上述通電裝置即SANTETSU ENGINEERING公司製造之depak連接於上述載置構件。
    培養條件設定為開始及結束溫度為37℃、二氧化碳5%、濕度100%，且於該環境下無論有無通電皆進行細胞培養。再者，細心注意培養器內的通電裝置的連接，使用檢測器VoltAlert(Fluke,Japan,www.fluke.com)頻繁地確認通電區域內完全沒有干涉一事。
    接著，將通電裝置的設定電流設定為0μA(無通電)、25μA、50μA、75μA此4群，並將電壓設定在10V～10000V之範圍內，正確地進行通電24小時且培養了各被試驗細胞。利用4℃的洗淨液迅速地洗淨通電後之培養細胞3次後，使用細胞刮刀(cell scraper)(Fisher Scientific,Pittsburgh,PA)自培養皿物理性地剝離細胞，並回收於微離心管中。於4℃去除離心後上清液，自各群細胞萃取mRNA並計量。
    (3)mRNA之萃取及利用PCR陣列(PCR array)之抗細胞凋亡相關基因之檢查(抗細胞凋亡效果之確認)
    藉由使用有離心純化管柱(Spin Column)(QIAGENInc.,Valencia,CA)之離心純化管柱法來純化各群mRNA。接著，使用mRNA 10ng轉錄成cDNA，使用該cDNA並針對84種與細胞凋亡相關的基因利用半定量性之PCR陣列(SuperArray Bioscience,Frederick,MD)來進行檢索。
    關於基因表現，將「相對於控制組之0μA(無通電)之群，其他群顯現出高出多少倍之表現」加以數值化，示於表1及表2。

    關於各基因的表現，若認為：將顯現與控制組之群相比表現1.5倍以上之基因設為增大，表現未達0.40之基因設為減弱，則有增大或減弱的基因如下所示。
    Bcl10(若增大，表示抗細胞凋亡效果)
    Bcl2/10(若減少，表示細胞凋亡效果)
    Naip1(若減少，表示細胞凋亡效果)
    Casp14(若增大，表示細胞凋亡效果)
    Hells(若增大，表示抗細胞凋亡效果)
    IL10(若增大，表示抗細胞凋亡效果)
    Lxh4(若增大，表示抗細胞凋亡效果)
    Nme5(若增大，表示抗細胞凋亡效果)
    Trp63(若增大，表示細胞凋亡效果)
    根據以上結果，於通電25～75μA之微弱電流之群，表現抗細胞凋亡效果的基因(特別是Bcl10、Hells、Lxh4、Nme5)增強。亦即，因為通電而顯現了抗細胞凋亡效果被誘導一事。特別是於通電50μA之微弱電流的群中其增強效果顯著，可藉由分子生物學之方法來明白NIH3T3細胞之通電24小時的時候之最適合的微弱電流值為50μA。
    (4)使用組織染色法(小室分析法(Chamber assay))之抗壞死效果確認
    4-1)AnnexinV×PI染色
    利用上述培養方法使NIH3T3細胞生長附著於小室(chamber)，利用檢測細胞凋亡細胞膜之AnnexinV(綠色)與檢測壞死細胞之Propidium Iodido(PI)(紅色)來進行雙染。通電裝置的設定電流設定為0μA(無通電)、25μA、50μA、75μA此4群。
    結果，相對於控制組之0μA(無通電)之群，於25μA、50μA、75μA之群中，通電後PI陽性細胞的比例減少。亦即，顯示出因為通電導致抗壞死效果被誘導。
    4-2)LC3×DAPI染色
    利用上述培養方法使NIH3T3細胞生長附著於小室，利用誘導壞死蛋白時出現的LC3蛋白(紅色)與檢測細胞核之DAPI(藍色)來進行雙染。
    結果，相對於控制組之0μA(無通電)之群，於25μA、50μA、75μA之群中，通電後LC3陽性細胞的比例減少。特別是觀察到相對於在控制組中LC3陽性細胞的比例為50%，於25μA之群中顯著下降為28%，於50μA之群中顯著下降為16%。於此系統中，亦顯示出因為通電導致抗壞死效果被誘導。
    (5)使用流式細胞儀法之抗細胞凋亡效果及抗壞死效果的確認
    於該實驗中，使用流式細胞儀法來確認抗細胞凋亡效果及抗壞死效果。
    利用上述培養方法使NIH3T3細胞生長附著於小室，利用檢測細胞凋亡細胞膜之AnnexinV(綠色)與檢測壞死細胞之Propidium Iodido(PI)(紅色)來進行雙染。通電裝置的設定電流設定為0μA(無通電)、25μA、50μA、75μA此4群。
    結果如表3所示，相對於控制組之0μA(無通電)之群，於25μA、50μA、75μA之群中，壞死細胞的比例、早期細胞凋亡細胞的比例、及晚期細胞凋亡細胞的比例減少。因此，藉由流式細胞儀法，顯示出因為通電導致抗細胞凋亡效果及抗壞死效果被誘導。
    進一步，作為比較實驗，將通電裝置的設定電流設定為15μA或100μA，且以相同的方法利用流式細胞儀法來確認抗細胞凋亡效果及抗壞死效果。其結果，於15μA或100μA之群中，與控制組之0μA之群相比，壞死細胞之比例為相同程度。關於細胞凋亡細胞之比例雖然可觀察到少量的減少，但與25μA～75μA之群相比該減少的程度為少量。亦即，於15μA或100μA之群中無法確認到顯著地誘導抗細胞凋亡效果及抗壞死效果。
    以上實驗經過多次實施亦可得到相同傾向之結果，可確認到再現性。 【產業上的可利用性】
    藉由本發明，可抑制活細胞內的細胞凋亡或壞死之發生，且可保持活細胞。特別是可抑制培養細胞內的細胞凋亡或壞死之發生。
    1．．．交流電壓施加裝置
    2．．．處理槽(培養機器)
    3．．．載置構件
    4．．．支持構件
    5．．．放置台
    6．．．保持活細胞的容器
    7．．．變壓器
    9．．．端子
    10、11．．．配線
    圖1，係表示於本發明之一實施型態中可使用的交流電壓施加裝置之結構的示意圖。
    1．．．交流電壓施加裝置
    2．．．處理槽(培養機器)
    2a．．．門
    3．．．載置構件
    4．．．支持構件
    5．．．放置台
    6．．．保持活細胞的容器
    7．．．變壓器
    9．．．端子
    10．．．配線
    11．．．配線
    权利要求:
    Claims (5)
    [1] 一種活細胞內之抗細胞凋亡及/或抗壞死誘導方法，以流通25μA以上75μA以下之電流的方式對活細胞施加交流電壓。
    [2] 如申請專利範圍第1項之活細胞內之抗細胞凋亡及/或抗壞死誘導方法，其中，活細胞為培養細胞。
    [3] 如申請專利範圍第1項之活細胞內之抗細胞凋亡及/或抗壞死誘導方法，其中，該交流電壓的電壓值為10V以上5kV以下。
    [4] 如申請專利範圍第2項之活細胞內之抗細胞凋亡及/或抗壞死誘導方法，其中，該交流電壓的電壓值為10V以上5kV以下。
    [5] 如申請專利範圍第1～4項中任一項之活細胞內之抗細胞凋亡及/或抗壞死誘導方法，其中，將該交流電壓施加於載置有保持該活細胞之收容器的載置構件。
    类似技术:
    公开号 | 公开日 | 专利标题
    Dang et al.2014|Autophagy regulates the therapeutic potential of mesenchymal stem cells in experimental autoimmune encephalomyelitis
    Sun et al.2013|Targeting Blockage of STAT3 in Hepatocellular Carcinoma Cells Augments NK Cell Functions via Reverse Hepatocellular Carcinoma–Induced Immune Suppression
    Scorrano2013|Keeping mitochondria in shape: a matter of life and death
    Schulz et al.2014|Atherosclerosis—multiple pathways to lesional macrophages
    Taylor et al.2017|Parkin‐mediated mitophagy is downregulated in browning of white adipose tissue
    Jia et al.2013|Molecular and cellular mechanisms of loss of residual hearing after cochlear implantation
    Pereira-Lopes et al.2013|The exonuclease Trex1 restrains macrophage proinflammatory activation
    Wei et al.2015|The role of mitochondria in mTOR‐regulated longevity
    Broxmeyer et al.2012|DEK regulates hematopoietic stem engraftment and progenitor cell proliferation
    Nerlov2010|Transcriptional and translational control of C/EBPs: the case for “deep” genetics to understand physiological function
    TWI535846B|2016-06-01|Anti-apoptotic or anti-necrotic induction
    HAdi et al.2015|Osteoclastic resorptive capacity is suppressed in patients receiving hyperbaric oxygen therapy
    López-Soto et al.2017|Involvement of autophagy in NK cell development and function
    Amoyel et al.2012|Functions of the Drosophila JAK-STAT pathway: Lessons from stem cells
    Dionne2014|Immune-metabolic interaction in Drosophila
    US10004899B2|2018-06-26|Electric pulse generator for electroporator and electroporator apparatus provided with electric pulse generator
    Gabler et al.2013|Contribution of micro RNA 24–3p and E rk1/2 to interleukin‐6‐mediated plasma cell survival
    Ko et al.2021|Mitophagy deficiency increases NLRP3 to induce brown fat dysfunction in mice
    Kim et al.2006|The novel cytokine p43 induces IL-12 production in macrophages via NF-κB activation, leading to enhanced IFN-γ production in CD4+ T cells
    Hack et al.2012|Wnt5a inhibits the CpG oligodeoxynucleotide‐triggered activation of human plasmacytoid dendritic cells
    Ermolaeva et al.2013|The innate immune system as mediator of systemic DNA damage responses
    Lee et al.2019|Rosiglitazone remodels the lipid droplet and britens human visceral and subcutaneous adipocytes ex vivo [S]
    Maraming et al.2018|Antitumor ability of KT2 peptide derived from leukocyte peptide of crocodile against human HCT116 colon cancer xenografts
    Recher et al.2001|Prenatal and adult growth hormone gene expression in rat lymphoid organs
    Mondal et al.2020|Expression kinetics of heat-induced genes and possible crosstalk between them in black Bengal goat
    同族专利:
    公开号 | 公开日
    EP2666852B1|2016-04-13|
    CN103261406A|2013-08-21|
    JP5819861B2|2015-11-24|
    US9206415B2|2015-12-08|
    EP2666852A1|2013-11-27|
    KR101549573B1|2015-09-03|
    US20130316429A1|2013-11-28|
    WO2012098864A1|2012-07-26|
    KR20130058746A|2013-06-04|
    EP2666852A4|2014-09-10|
    TWI535846B|2016-06-01|
    CN103261406B|2014-11-19|
    JPWO2012098864A1|2014-06-09|
    引用文献:
    公开号 | 申请日 | 公开日 | 申请人 | 专利标题
    US5387231A|1992-07-21|1995-02-07|Sporer; Patsy|Electrotherapy method|
    AT302264T|1995-08-25|2005-09-15|Affymetrix Inc A Delaware Corp|Freigabe von intrazellulärem material|
    US5817138A|1996-11-27|1998-10-06|Suzuki; James Y.|Multi-channel, interferential wave, micro current device and methods for treatment using micro current|
    AT271123T|2000-11-29|2004-07-15|Albert Scheller|Stammzellen, verfahren zu deren expansion in vitro sowie deren verwendung|
    JP2006167476A|2004-12-17|2006-06-29|Hakuju Inst For Health Science Co Ltd|電界による疾患治療方法|
    JP3939555B2|2002-01-17|2007-07-04|株式会社インテクト|電場ユニット装置|
    JP2004305046A|2003-04-03|2004-11-04|Mayatec Inc|物の酸化抑制方法及び交流電圧印加装置|
    CN2721133Y|2003-12-31|2005-08-31|中国医学科学院放射医学研究所|脉冲电磁场肿瘤治疗装置|
    US20100199861A1|2007-02-06|2010-08-12|Mayatec Co., Ltd.|Treating Apparatus|
    WO2009058959A1|2007-10-30|2009-05-07|Mcneil-Ppc, Inc.|Microcurrent device with a sensory cue|JP6209404B2|2013-09-19|2017-10-04|株式会社サンテツ技研|冷凍品の解凍方法|
    法律状态:
    优先权:
    申请号 | 申请日 | 专利标题
    JP2011008828||2011-01-19||
    [返回顶部]